Die vorliegende Arbeit behandelt die analytische Methodenentwicklung für die ‚KARAL’ Infusionslösung, die ‚gezielte Therapie‘ für Krebs, welche Ketoglutarsäure, 5-Hydroxymethyl-furfural, N-Acetyl-L-methionin und N-Acetyl-L-selenomethionin enthält, in einer pharmazeutischen Formulierung und biologischen Proben. Mittels eines Elutionsprogrammes zusammen mit bevorzugter Wellenlängenauswahl, waren die 4 Bestandteile von ‚KARAL' chromatographisch aufgelöst. Weitere Optimierungen, sowie Stabilitätenstudien die fähig sind, die wirksamen Substanzen und ihre Abbauprodukte zu bestimmen, wurden durchgeführt. Um die Konzentrationen in Proben von Humanprobanden zu überwachen wurden mehrere Methoden, einschließlich UV-, VIS-, DAD- und Fluoreszenz- Detektion eingesetzt. Zunächst wurde direkte Chromatographie versucht. N-Acetyl-L-selenomethionin und 5-Hydroxymethylfurfural, als Beispiele für den niedrigsten und hochdosiertesten Infusionenbestandteil, wurden mittels isokratischer Elution und Detektion bei 220 und 283 nm quantifiziert. Diese direkte Bestimmung hat sich als nicht befriedigend in bezüglich Detektion als auch auf Selektivität erwiesen. In der Folge wurden Derivatisierungsverfahren, einschließlich des Gebrauchs von 2-Nitrophenylhydrazin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin, zur Bestimmung herangezogen. Zuerst wurde das letztgenannte Reagenz benutzt um 5-Hydroxymethylfurfural in das entsprechende Hydrazone überzuführen, und um eine verbesserte Detektion zu erhalten. Diese Reaktion resultierte in 2 Stereoisomeren, nämlich das mehr thermodynamisch stabile E-2,4-Dinitrophenyl-5-hydroxymethyl-2-furaldehydhydrazon und sein Z-Analogon. Anschließend erfolgte die Festphasen-Extraktion mittels Octadecyl Säulchen für den gleichen Analyten im menschlichen Plasma mit annehmbarer Selektivität. Danach wurde das gleiche Gesamtverfahren mit Ketoglutarsäure untersucht. Gleichzeitige chromatographische Trennung der 2 Analyten mit ihren geometrischen Isomeren war nur möglich nach Hinzufügung von Trifluoressigsäure zur mobilen Phase. 2,4-Dinitrophenylhydrazin war empfindlicher für die weniger sterisch gehinderte und aktivere Carbonylsäure, während das Mononitrat-Reagenz umgekehrt günstiger für das größere Furfuralmolekül war. Jedoch hat sich 2-Nitrophenylhydrazin als überlegen gegenüber dem 2,4-Dinitro Analogon wegen besserer pH- Stabilität erwiesen. Um beide Analyten gleichzeitig zu extrahieren, wurden verschiedene Festphasensäulchen mit ‚Polymer hydrophilem-lipophilem Gleichgewicht’ gefunden. Dennoch war die maximale Wiederfindungsrate der Dicarboxylketosäure noch unzulänglich. Folglich wurde ein Doppelsäulchenarrangement, einschließlich des oben genannten und sein Ionenaustausch-Gegenstück, überlegt. Ausgezeichnete Wiederfindungsrate und Reinigung wurden nach Gebrauch mit dieser Kombination festgestellt. Als folgender Schritt wurde versucht die restlichen 2 Analyten, gleichzeitig zu quantifiezieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein wasserlösliches Carbodiimid als Kupplungsagens benutzt, um die Derivatisierung der carboxylsauren Carbonylfunktion von den N-acetylierten Schwefel- und Selen-Aminosäuren zu erlauben. N-Acetyl-L-selenomethionin, als der geringst konzentrierte Bestandteil der Infusionstherapie, wurde ausgewählt, um die neuen Bedingungen zu testen. Wegen zahlreicher störender Nebenprodukte im UV-Bereich und schwacher Detektion im VIS-Bereich wurden weitere Versuche in dieser Richtung eingestellt. Da photometrische Studien zeigten dass ein alkalisches Medium eine positive Wirkung auf die Detektion hat, sollte als Alternative zur Analyse des Substanzgemisches eine alkalische mobile Phase und eine pH-stabile Polymersäule verwendet werden. Obgleich gute Chromatogramme mit passender Trennung erhalten wurden, verhindert die Nachweisgrenze die Übertragung der Methode für biologische Proben. Eine bessere Option scheint, die Fluoreszenz-Derivatisierung mit Dansylhydrazin zu sein. Pilotstudien zeigten vielversprechende Ergebnisse, die durch weitere Optimierung leicht die erforderliche Empfindlichkeit in Biomatrizes erreichen könnten. Die validierte HPLC-Methode für Ketoglutarsäure und 5-Hydroxymethylfurfural wurde für biologische Proben als Kontrolle für die Zuverlässigkeit herangezogen. Ergebnisse haben einen Einblick in den biologischen Spiegel von Ketoglutarat in bösartigen Karzinomen mit Metastasen ermöglicht. Außerdem wurde die Probenselektivität als passend eruiert, weil die bis zu 10 verschiedenen als Begleitung verwendeten Medikamente die Quantifizierung nicht beeinflusst hat. Validierungsgrundprinzipien sind Hand in Hand mit den oben genannten analytischen und bioanalytischen Proben einhergegangen. Mehrere Protokolle wurden verwendet, von denen das neuartige ‚Genauigkeitsprofil’ sich als das Fähigste erwiesen hat. Dieses Protokoll basiert auf Messen des gesamten Fehlers, und prüft, ob die Ergebnisse und nicht die Parameter die Erfordernisse erfüllen.
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SWD-Schlagwörter: 20070103-Opus-to-ACC01
Schlagwörter deutsch: Ketoglutarat / Hydroxymethylfurfural / N-Acetyl-selenomethionin / Festphasenextraktion / Derivatisierung / HPLC-UV, -VIS, -DAD, -Fluoreszenz Detektoren / Genauigkeitprofil / Biomatrizes
Schlagwörter englisch: Ketoglutarate / Hydroxymethylfurfural / N-Acetyl-selenomethionine / Solid phase extraction / Derivatization / HPLC-UV, -VIS, -DAD, -Fluorescence detectors / Validation / Accuracy profile / Metastatic lung and mammary carcinoma
BK - Basisklassifikation: 44.42
Universität: Universität Graz
Fakultät: Naturwissenschaftliche Fakultät
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Dokumentart: Dissertation in gedruckter Form
Begutachter: Wintersteiger, Reinhold / Francesconi, Kevin
Sprache: englisch
Publikationsdatum: 12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Umfangsangabe: 147 S.
Akadem. Grad: Dr. rer. nat.
Erfassungsdatum: 03.01.2007
ID-Nr.: 7399
AC-Nr.:
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